相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡是進行光學活檢來診斷腫瘤，以及對富含脂質(zhì)的組織進行無標記成像的重要工具。目前標準內(nèi)窺鏡的直徑太大，無法在敏感組織內(nèi)使用。為了解決該問題，人們發(fā)展了基于多模光纖的CARS內(nèi)窺鏡：多模光纖具有高數(shù)值孔徑 （NA） ，可以提供與其他內(nèi)窺鏡相當?shù)膱D像質(zhì)量，并且由于多模光纖只有100 ?m左右，可以在損傷較小的情況下在組織深處成像。但是，由于四波混頻 （FWM） 和其他非線性過程，特別是在使用飛秒脈沖激發(fā)時，光纖內(nèi)部會產(chǎn)生較強的背景信號，該背景信號與樣品中產(chǎn)生的 CARS 信號在光譜上重疊，當同一根光纖同時用于激發(fā)和檢測時，無法被濾除，從而大大降低圖像對比度。

使用飛秒激光進行CARS內(nèi)窺鏡檢查的理想多模光纖探針要滿足兩個條件。首先，要有足夠高的帶寬，使所有波長聚焦到同一時間和空間點。第二，光纖中產(chǎn)生的FWM背景應該盡可能低。第一個要求排除了使用階躍折射率光纖（SI），因為SI光纖聚焦的位置嚴重依賴于波長，產(chǎn)生明顯拉長的焦點，從而降低了通常與非線性成像相關的切片能力。相反，梯度折射率光纖（GRIN）有足夠的帶寬聚焦飛秒激光脈沖，但由于光纖的自成像特性，在樣品平面上用來激發(fā)信號的聚焦點沿著探針多次重新成像，使得光纖內(nèi)部產(chǎn)生了泵浦光和斯托克斯光束在時間和空間上完全重疊的高強度點，進而產(chǎn)生極強的FWM信號。

為了防止光纖內(nèi)部形成致密的焦點，Pikálek等人將一小段SI光纖熔接GRIN光纖末端，設計了由GRIN光纖和SI光纖組成的復合探針［1］。

圖1 用于光纖表征和成像的實驗裝置［1］

實驗裝置的原理如圖1所示。首先1040 nm的斯托克斯光和800 nm泵浦光經(jīng)SF57玻璃展寬，擴束準直后輸入到空間光調(diào)制器（SLM），從SLM出射的±1級衍射進行偏振控制，之后依次經(jīng)過二向色鏡和耦合透鏡將激發(fā)光輸入到光纖內(nèi)。激發(fā)光聚到樣品表面，產(chǎn)生的信號可以前向探測（圖中沒畫出），也可以進行后向探測。

此外，利用校正模塊校準光纖輸出端的模式，確保在多模光纖末端獲得最佳焦點，如圖1A所示。圖1B展示了CARS的原理，通過改變泵浦光和斯托克斯光之間的時延調(diào)節(jié)拉曼位移。數(shù)值計算了GRIN光纖和復合光纖內(nèi)部的光電場，如圖１（C， D）所示，可以看出拼接一小段階躍折射率光纖使得GRIN光纖輸出端的場分布變?yōu)殡S機散斑模式，從而使自成像效應形成的焦點被分解成低強度焦點，而且由于階躍折射率光纖的波長依賴性強，泵浦光和斯托克斯光的焦點在空間上較難重疊，導致FWM信號降低。圖1E顯示了小鼠大腦和探針的相對大小圖，可以看出多模光纖尺寸較小，更適合于大腦內(nèi)部成像。

圖2 使用拼接和不拼接的多模光纖對熒光小球進行CARS成像［1］

作者使用三種不同光纖在未拼接和拼接1mm 階躍折射率光纖時分別進行透射成像，可看出基于自制GRIN光纖或YOFC光纖的拼接探頭能夠有效抑制背景噪聲，但是Prysmian光纖即使拼接，背景信號仍很強。因此，選擇光纖時須謹慎。將圖2A前兩張圖做差得到圖2B，可以看出有明顯的暗斑，說明不能通過簡單的做差方式得到?jīng)]有背景干擾的圖像。圖2C是后向探測得到的CARS圖像，可以看出使用拼接方法也能有效抑制背景信號。之后，作者測量了不同拼接長度時的圖像對比度，得到拼接長度約為1mm時，對比度最大，如圖2D所示。

圖3 組織成像［1］

此外，作者使用復合探針分別對小鼠的坐骨神經(jīng)和大腦內(nèi)部進行CARS圖像，并對小腦的髓磷脂同時進行CARS成像和TPEF成像，證明了這種復合探針可以實現(xiàn)多模態(tài)成像，如圖3所示。

綜上所述，作者使用由GRIN光纖和階躍折射率光纖拼接而成的復合探針，成功將非線性背景強度降低一個數(shù)量級以上，從而提高了CARS內(nèi)窺鏡的成像質(zhì)量。

參考文獻：

［1］ T． Pikálek， M． Stib?rek， S． Simpson， et al． Suppression of the non－linear background in a multimode fibre CARS endoscope． Biomed． Opt． Express 13， 862 （2022）．

       原文標題 : 多光子顯微成像技術之二十　基于復合探針的CARS內(nèi)窺鏡